Monkeypox Virus ຊຸດ PCR ເວລາຈິງ
ລາຍລະອຽດຜະລິດຕະພັນ
ຈຸດປະສົງການນໍາໃຊ້
ມັນຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການກວດພົບຂອງ Monkeypox Virus ໃນ serum ຂອງມະນຸດຫຼືຕົວຢ່າງ exudate lesion ໂດຍໃຊ້ລະບົບ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງ.
ຫຼັກການການທົດສອບ
ຜະລິດຕະພັນນີ້ແມ່ນລະບົບການກວດສອບ PCR ແບບສົດໆ Taqman® ທີ່ອີງໃສ່ fluorescent probe.primers ແລະ probes ສະເພາະແມ່ນຖືກອອກແບບມາສໍາລັບການກວດພົບເຊື້ອໂຣກ F3L ຂອງ Monkeypox Virus.ການຄວບຄຸມພາຍໃນທີ່ກໍາຫນົດເປົ້າຫມາຍ gene ອະນຸລັກຂອງມະນຸດຕິດຕາມການເກັບຕົວຢ່າງ, ການຈັດການຕົວຢ່າງແລະຂະບວນການ PCR ໃນເວລາທີ່ແທ້ຈິງເພື່ອຫຼີກເວັ້ນຜົນໄດ້ຮັບທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ - ລົບ.ຊຸດດັ່ງກ່າວເປັນລະບົບ lyophilized premix ຢ່າງເຕັມສ່ວນ, ເຊິ່ງປະກອບມີອຸປະກອນທີ່ຈໍາເປັນສໍາລັບການກວດສອບ Monkeypox Virus: enzyme amplification ອາຊິດ nucleic, enzyme UDG, ຕິກິຣິຍາ buffer, primer ສະເພາະແລະ probe.
ເນື້ອໃນຕົ້ນຕໍ
ອົງປະກອບທີ່ສະຫນອງໃຫ້ແມ່ນລະບຸໄວ້ໃນຕາຕະລາງ.
| ອົງປະກອບ | ຊຸດ | ສ່ວນປະກອບ |
| ເຊື້ອໄວຣັສ MonkeypoxLyophilized Premix | ທໍ່ PCR 8 ເສັ້ນ× 6 ຖົງ | primers, probes, dNTP/dUTP Mix, Mg2+, Taq DNA polymerase, UDG Enzyme |
| MPV ການຄວບຄຸມໃນທາງບວກ | 400 μL × 1 ທໍ່ | ລໍາດັບ DNA ທີ່ມີ gene ເປົ້າຫມາຍ |
| MPV ການຄວບຄຸມທາງລົບ | 400 μL × 1 ທໍ່ | ລໍາດັບ DNA ທີ່ປະກອບດ້ວຍສ່ວນພັນທຸກໍາຂອງມະນຸດ |
| ການແກ້ໄຂການລະລາຍ | 1 ມລ× 1 ທໍ່ | ຕົວຄົງທີ່ |
| ໃບຢັ້ງຢືນຄວາມສອດຄ່ອງ | 1 ຊິ້ນ | / |
ກະແສການດໍາເນີນງານ
1. ຕົວຢ່າງຄໍເລັກຊັນ:ຄວນເກັບເອົາຕົວຢ່າງໃສ່ທໍ່ທີ່ເປັນໝັນ
ດ້ວຍມາດຕະຖານເຕັກນິກວິຊາການ.
2. ການກະກຽມ Reagent (ພື້ນທີ່ກະກຽມ Reagent)
ເອົາອົງປະກອບຂອງຊຸດອອກ, ດຸ່ນດ່ຽງໃຫ້ເຂົາເຈົ້າຢູ່ໃນອຸນຫະພູມຫ້ອງສໍາລັບການນໍາໃຊ້ standby.
3. ການປຸງແຕ່ງຕົວຢ່າງ (ພື້ນທີ່ປະມວນຜົນຕົວຢ່າງ)
3.1 ການສະກັດເອົາອາຊິດນິວເຄຼຍ
ມັນໄດ້ຖືກແນະນໍາໃຫ້ເອົາຕົວຢ່າງຂອງແຫຼວ 200μL, ການຄວບຄຸມທາງບວກແລະການຄວບຄຸມທາງລົບສໍາລັບການສະກັດເອົາອາຊິດ nucleic, ອີງຕາມຂໍ້ກໍານົດແລະຂັ້ນຕອນທີ່ສອດຄ້ອງກັນຂອງຊຸດສະກັດ DNA ຂອງໄວຣັດ.
3.2 ການລະລາຍຜົງ Lyophilized ແລະການເພີ່ມແມ່ແບບ
ກະກຽມ Monkeypox Virus Lyophilized premix ຕາມຈໍານວນຕົວຢ່າງ.ຕົວຢ່າງຫນຶ່ງຕ້ອງການທໍ່ PCR ທີ່ມີຜົງ Lyophilized premix.ການຄວບຄຸມທາງລົບ & ການຄວບຄຸມໃນທາງບວກຄວນໄດ້ຮັບການປະຕິບັດເປັນສອງຕົວຢ່າງ.
(1) ຕື່ມການແກ້ໄຂການລະລາຍ 15μL ເຂົ້າໄປໃນທໍ່ PCR ແຕ່ລະທໍ່ທີ່ມີ Lyophilized premix, ຫຼັງຈາກນັ້ນເພີ່ມ 5μL ສະກັດຕົວຢ່າງ / ການຄວບຄຸມທາງລົບ / ການຄວບຄຸມທາງບວກເຂົ້າໄປໃນທໍ່ PCR ແຕ່ລະຄົນຕາມລໍາດັບ.
(2) ກວມເອົາທໍ່ PCR ແຫນ້ນ, flick ທໍ່ PCR ດ້ວຍມືຈົນກ່ວາຝຸ່ນ lyophilized ຈະລະລາຍຫມົດແລະປະສົມ, ເກັບກໍາຂອງແຫຼວລົງລຸ່ມຂອງທໍ່ PCR ໂດຍການ centrifugation ຄວາມໄວຕ່ໍາທັນທີ.
(3) ຖ້າຫາກວ່ານໍາໃຊ້ເຄື່ອງມື PCR ທີ່ໃຊ້ເວລາຈິງທົ່ວໄປສໍາລັບການກວດສອບ, ຫຼັງຈາກນັ້ນໂດຍກົງໂອນ PCR tubes ກັບພື້ນທີ່ຂະຫຍາຍ;ຖ້າໃຊ້ BTK-8 ສໍາລັບການກວດສອບ, ຫຼັງຈາກນັ້ນຈໍາເປັນຕ້ອງປະຕິບັດການດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ໂອນຂອງແຫຼວ 10 μLຈາກທໍ່ PCR ໄປຫາຊິບຕິກິຣິຍາທີ່ດີຂອງ BTK-8.ທໍ່ PCR ໜ່ວຍ ໜຶ່ງ ກົງກັບ ໜຶ່ງ ໃນຊິບ.ໃນລະຫວ່າງການດໍາເນີນການທໍ່, ໃຫ້ແນ່ໃຈວ່າ pipette ແມ່ນ 90 ອົງສາຕັ້ງ.ຄໍາແນະນໍາຂອງທໍ່ທໍ່ aerosol barrier ຄວນຖືກວາງໄວ້ຢູ່ໃຈກາງຂອງນ້ໍາດີດ້ວຍແຮງປານກາງແລະຢຸດເຊົາການຍູ້ pipette ເມື່ອມັນມາຮອດເກຍທໍາອິດ (ເພື່ອຫຼີກເວັ້ນການຟອງ).ຫຼັງຈາກນໍ້າສ້າງເຕັມແລ້ວ, ເອົາແຜ່ນຊິບຕິກິຣິຍາອອກເພື່ອປົກປິດນໍ້າສ້າງທັງໝົດ ແລະ ຊິບຈະຖືກໂອນໄປຫາພື້ນທີ່ກວດຫາການຂະຫຍາຍ.
4. ການຂະຫຍາຍ PCR (ພື້ນທີ່ກວດຫາ)
4.1 ເອົາທໍ່ PCR / ຊິບຕິກິຣິຍາເຂົ້າໄປໃນຖັງຕິກິຣິຍາແລະຕັ້ງຊື່ຂອງແຕ່ລະຕິກິຣິຍາໄດ້ດີໃນລໍາດັບທີ່ສອດຄ້ອງກັນ.
4.2 ການຕັ້ງຄ່າ fluorescence ກວດພົບ: (1) Monkeypox virus (FAM);(2) ການຄວບຄຸມພາຍໃນ (CY5).
4.3 ດໍາເນີນການອະນຸສັນຍາການຖີບລົດຕໍ່ໄປນີ້
ອະນຸສັນຍາຂອງ ABI7500, Bio-Rad CFX96, SLAN-96S, QuantStudio:
| ຂັ້ນຕອນ | ອຸນຫະພູມ | ເວລາ | ຮອບວຽນ | |
| 1 | ກ່ອນການເກີດຜິວໜັງ | 95℃ | 2 ນາທີ | 1 |
| 2 | ລັກສະນະ | 95℃ | 10 ວ | 45 |
| Annealing, ການຂະຫຍາຍ, ການຊື້ fluorescence | 60 ℃ | 30 ວ | ||
ອະນຸສັນຍາຂອງ BTK-8:
| ຂັ້ນຕອນ | ອຸນຫະພູມ | ເວລາ | ຮອບວຽນ | |
| 1 | ກ່ອນການເກີດຜິວໜັງ | 95℃ | 2 ນາທີ | 1 |
| 2 | ລັກສະນະ | 95℃ | 5 ສ | 45 |
| Annealing, ການຂະຫຍາຍ, ການຊື້ fluorescence | 60 ℃ | 14 ສ | ||
5. ການວິເຄາະຜົນໄດ້ຮັບ (ກະລຸນາເບິ່ງຄູ່ມືຜູ້ໃຊ້ເຄື່ອງມື)
ຫຼັງຈາກຕິກິຣິຍາ, ຜົນໄດ້ຮັບຈະຖືກບັນທຶກໄວ້ໂດຍອັດຕະໂນມັດ.ກົດ "ວິເຄາະ" ເພື່ອວິເຄາະ, ແລະເຄື່ອງມືຈະຕີຄວາມຫມາຍຄ່າ Ct ຂອງແຕ່ລະຕົວຢ່າງໃນຖັນຜົນໄດ້ຮັບໂດຍອັດຕະໂນມັດ.ຜົນໄດ້ຮັບການຄວບຄຸມທາງລົບແລະທາງບວກຈະສອດຄ່ອງກັບດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້ "6. ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ".
6. ການຄວບຄຸມຄຸນນະພາບ
6.1 ການຄວບຄຸມທາງລົບ: ບໍ່ມີ Ct ຫຼື Ct>40 ໃນຊ່ອງ FAM, Ct≤40 ໃນຊ່ອງ CY5 ທີ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍປົກກະຕິ.
6.2 ການຄວບຄຸມໃນທາງບວກ: Ct≤35 ໃນຊ່ອງ FAM ທີ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍປົກກະຕິ, Ct≤40 ໃນຊ່ອງ CY5 ທີ່ມີເສັ້ນໂຄ້ງຂະຫຍາຍປົກກະຕິ.
6.3 ຜົນໄດ້ຮັບແມ່ນຖືກຕ້ອງຖ້າຫາກວ່າເງື່ອນໄຂຂ້າງເທິງທັງຫມົດແມ່ນບັນລຸໄດ້.ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນ, ຜົນໄດ້ຮັບບໍ່ຖືກຕ້ອງ.
ການຕີຄວາມໝາຍຜົນ
ຜົນໄດ້ຮັບຕໍ່ໄປນີ້ແມ່ນເປັນໄປໄດ້:
| ຄ່າ Ct ຂອງຊ່ອງ FAM | ຄ່າ Ct ຂອງຊ່ອງ CY5 | ການຕີຄວາມໝາຍ | |
| 1# | ບໍ່ມີ Ct ຫຼື Ct>40 | ≤40 | Monkeypox virus ລົບ |
| 2# | ≤40 | ຜົນໄດ້ຮັບໃດໆ | Monkeypox ເຊື້ອໄວຣັສໃນທາງບວກ |
| 3# | 40–45 | ≤40 | ການທົດສອບຄືນໃຫມ່;ຖ້າມັນຍັງເປັນ 40-45, ລາຍງານເປັນ 1# |
| 4# | ບໍ່ມີ Ct ຫຼື Ct>40 | ບໍ່ມີ Ct ຫຼື Ct>40 | ບໍ່ຖືກຕ້ອງ |
ຫມາຍເຫດ: ຖ້າຜົນໄດ້ຮັບບໍ່ຖືກຕ້ອງ, ຕົວຢ່າງຕ້ອງໄດ້ຮັບການເກັບກໍາແລະທົດສອບອີກເທື່ອຫນຶ່ງ.
ຂໍ້ມູນການສັ່ງຊື້
| ຊື່ຜະລິດຕະພັນ | ແມວ.ບໍ່ | ຂະໜາດ | ຕົວຢ່າງ | ຊີວິດຊັ້ນວາງ | Trans.& ສະໂຕ.ອຸນຫະພູມ. |
| Monkeypox Virus ຊຸດ PCR ເວລາຈິງ | B001P-01 | 48 ການທົດສອບ / ຊຸດ | Serum/ Lesion Exudate | 12 ເດືອນ | -25～-15℃ |
